1925年6月3日，五卅惨案发生后的第三天，圣约翰大学的学生和部分中国教师在校内降半旗，悼念在南京路上被英国巡捕枪杀的民众。校长卜舫济（Francis Lister Hawks Pott）下令收起旗帜，禁止学生在校内举行悼念活动。学生与校方交涉不果，数百名学生和十几位中国教师宣布离校。离校师生在各界支持下另办了一所大学，同年秋天开学，取名光华大学。
这件事是圣约翰历史上最大的一次风潮，也集中反映了这所教会大学在中国所处的位置：它由美国人创办和管理，用英语教学，培养的学生在中国的外交界、实业界和教育界有很大影响，又不断因为与中国社会和中国政府的关系而陷入争议。
梵王渡的书院
1879年，美国圣公会上海教区主教施约瑟（Samuel Isaac Joseph Schereschewsky）把教会原有的两所书院合并，在上海西郊苏州河边的梵王渡建立圣约翰书院（St. John's College）。苏州河在这里拐了一个大弯，校园三面环水。施约瑟精通多种语言，曾参与把《圣经》译成中文官话，后来因病离开上海，但一直被视为学校的创办人。
书院初期以中文教学为主，兼授英文和神学。1886年，年轻的美国传教士卜舫济来校任教，1888年起主持校务。在他的主持下，圣约翰逐步改为以英语为主要教学语言，增设文理和医学课程。1905年，学校在美国华盛顿哥伦比亚特区注册，改称圣约翰大学（St. John's University），毕业生的学位可以得到美国大学的承认。卜舫济担任校长直到1941年，前后五十余年，是圣约翰历史上影响最大的人物。
1894年到1895年，学校建成一座以施约瑟命名的教学楼，称怀施堂（Schereschewsky Hall）。这座楼用西式的砖砌外廊和内院，屋顶采用中国式的歇山顶和起翘的屋角，是近代中国较早把中国传统屋顶用在西式教学楼上的实例之一。此后校园里又陆续建起科学馆、图书馆、体育馆和宿舍，形成了一片以红砖建筑和草坪为主的校园。
1896年，学校设立医学部，后来发展为圣约翰大学医学院。1914年，医学院与美国宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）医学院建立合作关系，一度称为宾夕法尼亚大学医学院在华分校，按照美国医学院的标准授课，培养了颜福庆等一批中国医学界的人才。圣约翰还是中国较早设立土木工程科系的大学之一。
英语与校风
圣约翰最突出的特点是英语教学。除国文课外，大部分课程用英语讲授，教材多是美国大学的原版书籍，学生之间也常用英语交谈。这使圣约翰的毕业生在洋行、海关、外交机构和外资企业中很受欢迎。学校的学费较高，学生多来自上海和江浙的富裕家庭。
批评者认为，圣约翰的学生英语好而国文差，对中国社会缺乏了解。林语堂1916年从圣约翰毕业，他在晚年的自传里提到，自己在圣约翰专心学英文，中文底子薄弱，到北京清华学校任教以后才下功夫补读中国典籍。学校的校训是英文的「光与真理」（Light and Truth），中文校训取自《论语》：「学而不思则罔，思而不学则殆。」
圣约翰很重视体育，学校的田径、足球和划船运动在上海的学校中颇有名气，是上海较早开展现代体育的学校之一。
校友
圣约翰的学生中，后来成名的人很多。外交界有顾维钧，他在圣约翰读书后赴美留学；施肇基是圣约翰早期的学生。政界、金融界有宋子文，他从圣约翰毕业后去哈佛大学深造，还有后来在台湾担任要职的严家淦。文化界有林语堂、邹韬奋，邹韬奋1921年从圣约翰毕业，后来主编《生活》周刊，1951年怀施堂改名为韬奋楼，就是为了纪念他。实业界有荣毅仁，他1937年从圣约翰毕业。建筑师贝聿铭少年时在圣约翰附属中学读书，后来赴美留学。
立案之争与院系调整
1920年代收回教育权运动兴起以后，北京政府和南京国民政府先后规定，外国人在华设立的学校必须向中国政府立案，校长须由中国人担任，宗教课程不得列为必修。大多数教会大学在1920年代末至1930年代初陆续立案，圣约翰因为校方和美国圣公会不愿接受这些条件，一直拖延，直到1947年才完成立案。1941年卜舫济退休以后，校长先后由美国人和中国人担任。
太平洋战争期间，上海被日军全面占领，圣约翰在困难中维持办学。战后学校恢复，学生人数有所增加。1949年以后，教会大学与美国差会的联系逐步切断。1952年全国高等学校院系调整，圣约翰大学被撤销，各院系分别并入复旦大学、华东师范大学、同济大学、上海财经学院等校，医学院与其他医学院合并组成上海第二医学院。梵王渡的校园由新成立的华东政法学院使用，今天是华东政法大学的长宁校区，怀施堂等老建筑大多保存下来。
年表
- 1879年 施约瑟在梵王渡创办圣约翰书院。
- 1888年 卜舫济主持校务。
- 1894年 怀施堂动工，次年落成。
- 1905年 在美国注册，改称圣约翰大学。
- 1925年 五卅离校风潮，离校师生创办光华大学。
- 1941年 卜舫济退休。
- 1947年 向中国政府立案。
- 1952年 院系调整，圣约翰大学撤销。
